CO2激光用于微流控免疫分析芯片加工的初步研究

微流控芯片技术是20世纪90年代中期建立起来的一种新的微型化快速分析平台，它是通过微细加工技术在芯片上构建由储液池、微反应室、微管道等微功能元件构成的微流路系统，加载生物样品和反应液后，在压力泵或者电场作用下形成微流路，于芯片上进行一种或连续多种的反应，达到对样品高通量快速分析的目的。微流控芯片的加工方法有很多种，传统的微流控芯片是以硅片作为基底材料，通过光刻技术高精密度地复制二维图形，这种方法可以获得高精密度的微流控芯片，但是光刻技术存在对加工环境要求高、加工成本高以及加工周期长等缺点。本实验以聚甲基丙烯酸甲酯为基底材料，通过CO2激光直接加工的方法制备微流控芯片，并用于免疫分析。
    1  实验方法
    1.1  仪器与试剂PMMA（上海天进塑胶制品有限公司）、CO2激光器（洛阳天方设备有限公司）、BPCL-2-KGC微弱发光测量仪及分析软件（中科院生物物理研究所）、HL-2恒流泵（上海沪西分析仪器公司）、羧基磁珠（山东滋博赫兹生物公司）、AFP抗体（武汉博士德公司）、AFP 标准品(Sigma公司）、辣根过氧化物酶标记的AFP抗体（深圳晶美公司）、鲁米诺（Sigma）。
    1.2  激光加工装置的构建  激光加工装置主要由计算机控制系统、开关电源、冷却水循环、CO2激光器和光学光路、电路系统6个部分组成。其结构图如图1所示。CO2激光器购自洛阳天方设备有限公司，激光的波长10.6um，输出功率0~50W，工作模式是连续运行。在本系统中，激光器固定，激光器产生的激光通过聚焦棱镜聚焦在芯片基底上，将设计的微流路CAD图形转换成准分子激光微加工系统可识别的指令，通过工作台的运动来完成芯片加工。聚焦透镜的焦距是20mm。采用北京新立龙软件有限公司的新立龙软件对系统进行控制。

     1.3.1  基片的清洗   根据所设计的芯片大小，截取一定面积的PMMA基片，放置于装有三蒸水的玻璃烧杯中，置于超声清洗器中进行清洗，一共清洗3次，每次清洗5min，以除掉PMMA基片表面黏附的灰尘和其他杂质。清洗完成后，用高纯N2流吹干。
     1.3.2  激光加工   采用三维辅助设计软件（AutoCAD）设计微流路图形，将洗净的PMMA基片放置于激光加工装置的固定平台上，打开激光加工装置的电源，打开激光器的冷却循环水电源，设置好激光器的强度和激光的扫描速度，将设计的微流路CAD图形转换成准分子激光微加工系统可识别的指令，采用激光微加工系统在聚甲基丙烯酸甲酯基片表面获得微流路，采用同样的方法加工具有进样口和出样口的芯片盖片。
     1.3.3  微流控芯片的表面修饰   将加工好的芯片在异丙醇溶液超声清洗，然后用160g/L的氢化铝锂乙醚溶液对通道表面进行处理30min，处理完成后再分别用异丙醇和三重蒸馏水进行超声清洗，用高纯N2流吹干。
     1.3.4  热压键合   将处理好的芯片与基片置于热压装置两片玻璃片之间，放入简易热压装置，压紧，88~95摄氏度，1.0~1.4压力下热键合30min获得完整的芯片。
    1.4  微流控芯片用于免疫分析的研究" 将加工好的微流控芯片及其与其相连的外部管道置于一密封舱内，以恒流泵控制管道内流体的流动。以甲胎蛋白（alpha-fetoprotein,AFP）为检测对象，采用双抗夹心免疫分析法进行检测，以超顺磁珠作为固化抗体的载体，电磁场控制超顺磁珠的吸附与释放，以辣根过氧化物酶-鲁米诺化学发光系统显示免疫反应。信号检测处理系统采用BPCL-2-KGC微弱发光测量仪对免疫反应的化学发光信号进行放大及分析。
    2  实验结果
    2.1  激光加工强度与激光加工次数对微流控芯片通道的影响
    2.1.1  芯片通道深度与激光强度的关系  在其他条件不变的情况下，改变激光强度观察通道深度变化的情况，在加工过程中激光强度达到5W时才开始在PMMA材料上烧蚀出条纹，以后随着激光束强度的增加，通道深度也随着线性增加（图2）。

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    2.1.2  芯片通道深度与激光加工次数的关系  我们将激光强度固定在25W，观察芯片通道深度的变化。在激光强度固定不变的情况下，芯片通道深度随着激光加工次数的增加而增加（图3），由于激光加工速度很快，流道很窄，激光加工过程中气化的材料没挥发出去又重新凝结在壁面，因此芯片通道深度并不是随着激光加工的次数而成倍增长。
    2.1.3  氢化铝锂对通道的修饰作用   采用激光微加工PMMA获得的芯片通道表面比较不平整度较大，通道壁黏附有PMMA气化以后留下的残渣，必须要对通道进行处理。首先将加工好的芯片放于装有三重蒸馏水的玻璃烧杯中进行超声清洗，一共需要超声清洗3次，以除掉通道壁黏附的残渣。然后在微通道中加入160g/L的氢化铝锂乙醚溶液，氢化铝锂与PMMA发生剧烈反应，产生大量的气泡，随后在通道内有大量的白色沉淀生成，进行超声清洗后在体视显微镜下可以观察到通道表面的不平整度降低了，说明氢化铝锂对通道表面有钝化作用（图4）

    2.2  微流控芯片用于免疫分析的研究   我们采用该系统对AFP进行了双抗体夹心化学发光免疫分析，图5是AFP浓度分别为0、10、20、40、60、80、100ng/mL 时用该系统测得的化学发光曲线。在去除试剂空白后，以AFP 浓度为横坐标，各浓度AFP化学发光曲线的积分值为纵坐标制备标准曲线，其线性回归方程为：AFP浓度（ ng/mL）=化学发光积分值*3.64X10*-6-0.22，相关系数为O.998，表明该系统可以用于免疫分析。